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circRNA翻譯相關載體構建
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2019-08-16 | 1131 次瀏覽 | 分享到:

circRNA翻譯驗證(T系列)


1 circRNA翻譯驗證載體示意圖

 

T1:  circRNA-OE (circRNA過表達載體)

使用吉賽生物專利技術的第五代circRNA過表達載體進行構建,利用載體攜帶的側翼成環框架(IR)使插入的circRNA序列準確剪切成環表達。包含細胞轉染和RT-qPCR檢測,保證插入的circRNA序列準確剪切成環過表達。

T2:  circRNA-3xFlag (3xFlag標簽的circRNA過表達載體)

circRNA-OE載體的基礎上,于預測ORF的終止密碼子前添加3xFlag標簽序列,利用載體攜帶的側翼成環框架(IR)使插入的含3xFlag標簽的circRNA序列準確剪切成環表達。包含細胞轉染和RT-qPCR檢測,保證插入的circRNA序列準確剪切成環過表達。

T3:  circRNA-3xFlag-ATG(含3xFlag標簽并刪除ATGcircRNA過表達載體)

circRNA-3xFlag載體的基礎上,刪除預測ORF的起始密碼子ATG,利用載體攜帶的側翼成環框架(IR)使插入的含3xFlag標簽的circRNA序列準確剪切成環表達。

T4:  circRNA-3xFlag-NC (3xFlag標簽并刪除下游IR的載體,即不能成環的陰性對照)

circRNA-3xFlag載體的基礎上,刪除載體下游的成環框架(IR),使能轉錄生成與circRNA-3xFlag相同的RNA序列但不剪切成環。該載體可作為陰性對照使用。

T5:  circRNA-3xFlag-**aa (預測ORF的線性表達載體,即**aa的陽性對照)

使用與吉賽生物專利技術的第五代circRNA過表達載體相同骨架(不含成環框架)的載體進行構建,插入預測的ORF全長,使能轉錄生成線性化的ORF全長序列,并能正常翻譯生成預測的多肽**aa。該載體可作為陽性對照使用。

 

注:

1. 本系列使用3xFlag標簽序列,也可更換為V5HA等其他標簽。

2. 標簽插入位置為ORF的終止密碼子之前,即多肽**aaC端。

 

參考文獻:

1. Pamudurti NR, Bartok O, Jens M, Ashwal-Fluss R, Stottmeister C, Ruhe L, et al.. Translation of CircRNAs. Mol Cell 2017;66:9-21.e7. doi: 10.1016/j.molcel.2017.02.021.

2. Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, Morlando M, Briganti F, Sthandier O, et al.. Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol Cell 2017;66:22-37.e9. doi: 10.1016/j.molcel.2017.02.017.

3. Zhang M, Huang N, Yang X, Luo J, Yan S, Xiao F, et al.. A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis. Oncogene. 2018 Mar;37(13):1805-1814. doi: 10.1038/s41388-017-0019-9. Epub 2018 Jan 18.

4. Zhang M, Zhao K, Xu X, Yang Y, Yan S, Wei P, et al.. A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma. Nat Commun. 2018 Oct 26;9(1):4475. doi: 10.1038/s41467-018-06862-2.

 

IRES活性檢測(R系列)

 

2 IRES驗證載體示意圖

 

R1:  Empty Vector (Luc2空載體)

Luc2報告載體是基于海腎熒光素酶(Renilla Luciferase, R-Luc)和螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase, F-Luc)的cap-independent translation報告載體,R-Luc5’ m7G帽子結構介導翻譯起始,F-Luc只在插入有IRESInternal Ribosome Entry Site)活性的序列或介導翻譯起始序列時可以翻譯。Luc2空載體含有多克隆酶切位點,命名為Luc2-IRES- Report

R2:  EMCV IRES (插入EMCV IRES序列的Luc2報告載體陽性對照)

Luc2陽性對照載體含有EMCV IRES序列,命名為Luc2-EMCV-IRES-Report

R3:  IRES (插入預測IRES序列的Luc2報告載體)

    使用Luc2-IRES-Report載體進行構建,插入預測的IRES序列全長。

R4:  IRES-Del1 (插入預測IRES前半部分序列的Luc2報告載體)

使用Luc2-IRES-Report載體進行構建,插入部分預測的IRES序列(已刪除后半部分)。

R5:  IRES-Del2 (插入預測IRES后半部分序列的Luc2報告載體)

使用Luc2-IRES-Report載體進行構建,插入部分預測的IRES序列(已刪除前半部分)。

 

參考文獻:

1. Pamudurti NR, Bartok O, Jens M, Ashwal-Fluss R, Stottmeister C, Ruhe L, et al.. Translation of CircRNAs. Mol Cell 2017;66:9-21.e7. doi: 10.1016/j.molcel.2017.02.021.

2. Yang Y, Gao X, Zhang M, Yan S, Sun C, Xiao F, et al.. Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis. J Natl Cancer Inst. 2018 Mar 1;110(3). doi: 10.1093/jnci/djx166.

3. Zhang M, Huang N, Yang X, Luo J, Yan S, Xiao F, et al.. A novel protein encoded by the circular form of the SHPRH gene suppresses glioma tumorigenesis. Oncogene. 2018 Mar;37(13):1805-1814. doi: 10.1038/s41388-017-0019-9. Epub 2018 Jan 18.

4. Zhang M, Zhao K, Xu X, Yang Y, Yan S, Wei P, et al.. A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma. Nat Commun. 2018 Oct 26;9(1):4475. doi: 10.1038/s41467-018-06862-2.



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