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珍藏版【下集】染色體外環狀DNA的研究歷程、功能機制和研究方法
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2019-12-11 | 937 次瀏覽 | 分享到:


3、eccDNA的功能機制

3.1 eccDNA的常見功能

eccDNA作為獨立的DNA分子,在細胞中發揮功能的方式和機制是非常重要的問題。目前對eccDNA的功能有一定的研究,但相信隨著研究的不斷深入,未來一定會有更多新的功能被發現。Anindya Dutta等在他們的綜述文章中系統的匯總了eccDNA的主要功能,早期的研究就發現eccDNA可以介導細胞耐藥作用,此外在癌基因擴增,腫瘤異質性調控,腫瘤進化等方面均起了非常重要的作用([12])。eccDNA的主要功能模型如下圖所示,左側的部分是作者預測的可能的作用機制,右側是已經有實驗證據支持的功能模型。

圖7 常見eccDNA功能([12]


3.2 常見eccDNA攜帶基因

eccDNA可以攜帶完整的基因,一種模型認為eccDNA形成的早期是可以從基因組的大部分區域形成,但如果所攜帶的基因組片段沒有給細胞帶來生存優勢,這些DNA片段將會隨著細胞分裂過程而逐漸稀釋和丟失,而當所攜帶的基因對細胞的生存有力,則可能被保留下來,并在細胞增殖分裂過程中不斷被富集([20])。腫瘤中eccDNA常攜帶癌基因,常見的包括c-Myc,EGFR,MYCN,PDGFRA,MET等等([20]),在一些藥物誘導生成的eccDNA中往往攜帶耐藥相關的基因,比如氨甲喋呤耐藥的小鼠細胞攜帶DHFR基因等等([4])。


圖8  eccDNA的形成和作用機制 ([21]


3.3 eccDNA遺傳機制

eccDNA不帶著絲粒元件,因此不能通過有絲分裂的方式均勻分配到分裂后的細胞中。但eccDNA可以通過不對稱分布,在腫瘤細胞中實現定向富集。尤其是攜帶了癌基因的腫瘤細胞,會因為癌基因拷貝數的增高而獲得生長速度的優勢,不對稱分裂過程中攜帶越多的eccDNA,細胞就會獲得越強的生存優勢,因此這種基于不對稱分布狀態的遺傳機制能在快速增殖的細胞中定向富集([20])。


圖9 eccDNA不均等分布遺傳作用模型 ([20]


4、
eccDNA主要研究方法

eccDNA的研究還處于不斷發展的階段,已報道的文章所使用的研究方法都值得我們學習借鑒,包括如何分析eccDNA,如何證明eccDNA是環狀的,如何研究eccDNA的高級結構等。


4.1 如何分析eccDNA?

1)光學顯微鏡觀察

eccDNA分子大小在1-5Mb,用普通的DNA染料和光學顯微鏡觀察可以在視野中看到處于M期的細胞中存在的染色體外小DNA信號,其中一些就是eccDNA的信號。近幾年發展起來的超高分辨率顯微鏡技術也可用于eccDNA的成像。Paul S. Mischel團隊就曾用3D-SIM的超分辨成像技術進行eccDNA的成像分析([10])。

圖10  3D-SIM超分辨顯微鏡觀察eccDNA ([10]


2)電鏡觀察

光學顯微鏡的分辨率有限,沒法實現對eccDNA更精細結構的觀察和分析,電子顯微鏡可以解決這一問題。eccDNA的發現過程一直有電鏡的貢獻,最早的報道雙微體結構的發現,直到最近的eccDNA研究工作都用到了電子顯微鏡。掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)都可以用于eccDNA的成像觀察。還有一種將同一視野的光學信號和電鏡信號進行疊加的光電聯用技術也可用于eccDNA的成像觀察。


圖11 光電聯用觀察eccDNA ([10]


3)密度梯度離心

氯化銫密度梯度離心是早期研究DNA的重要技術方法,可以分離出環狀的DNA分子。但這種基于密度梯度離心的方法對細胞樣品的需求量很大,尤其是研究eccDNA這樣的低豐度物質,樣品需求量會非常大,現在用的已經比較少了,但也依然是一個可選擇的分離eccDNA的方法。


4)ATAC-see

Tn5轉座子可以在裸露的基因組DNA區域隨機插入,利用這一特點,可以實現對染色質開放性的檢測。通過ATAC染色,將裸露的DNA區域利用Tn5轉座酶將其染色,結合FISH和DAPI染色,可以實現對目標信號的定位觀測。


圖12  ATAC-see觀測疏松染色質 ([10]


5)Southern Blot

核酸雜交技術在DNA和RNA研究中應用非常廣泛,針對eccDNA的探針進行Southern雜交也是可以用于eccDNA研究的方法之一。


6)熒光原位雜交(FISH)

利用eccDNA的熒光探針在細胞樣品中檢測eccDNA。FISH是比較有效的觀察已知信息eccDNA的重要工具。


7)三代測序

二代測序的序列讀長都比較短,一般小于500bp,可以用于分析eccDNA中的junction point信息,但eccDNA往往比較大,并且往往攜帶多個染色質來源的序列,因此僅用二代測序很難完整構建出eccDNA的全長序列。三代測序技術顯著提高了測序中分子讀長的問題,可以用于eccDNA的全長序列鑒定。


4.2 如何證明eccDNA是環狀的?

上述觀察eccDNA的技術方法中很多也可以用于證明它是環狀分子,包括直接的電鏡觀察,三代測序等技術都可以用于證明eccDNA是環狀分子。


1)雙向電泳

環狀DNA和線性DNA的結構有所不同,可以通過垂直方向的雙向電泳將其分開。這種雙向電泳技術還可用于DNA復制叉的研究。


圖13 雙向電泳分析eccDNA的結構 ([22]


4.3 eccDNA的高級結構研究方法

1)ChIP-seq

eccDNA常伴隨高度開放的染色質結構,也結合了組蛋白,且其中的H3K27ac修飾狀態非常高,因此以H3K27ac等蛋白進行ChIP分析是研究eccDNA的重要手段。


2)4C-seq

是分析染色質高級結構的一種方法,主要原理是先用內切酶對基因組DNA做一次消化,然后進行連接,去除交聯之后再做一次消化和鏈接,最后分析基因組相互作用的信息。4C-seq能更清晰的分析同一段染色質與多個染色質相互作用的情況([23])。


圖14  4C-seq原理 ([23]


3)PLAC-seq

該技術主要用于分析染色質不同區域相互作用,樣品先經過限制性內切酶處理,然后用連接酶將離得比較近的DNA片段連接在一起。如果不同區域的染色質空間上比較靠近,就會被連接在一起,這樣經過ChIP等測序分析后,就可以找出遠距離相互作用的染色質信息([24])。該技術的原理示意圖如下:


圖15  PLAC-seq原理 ([24]


4)ATAC-seq

Tn5轉座子可以在裸露的基因組DNA區域隨機插入,利用這一特點,可以實現對染色質開放性的檢測。


圖16  ATAC-seq用于eccDNA的開放性分析 ([10]


4.4 幾個分析工具及其主要工作原理

1)AmpliconArchitect

Paul S. Mischel團隊開發的專門用于尋找基因組來源的eccDNA,主要原理是基于全基因組測序的數據比對結果,自動檢索基因組斷裂點和其他基因組擴增子的區域,結合CNV和SV的結果,形成eccDNA完整序列的報告([25])。

工具的下載地址:

https://github.com/virajbdeshpande/AmpliconArchitect


圖17  AmpliconArchitect工具工作原理 ([25]


2)AmpliconReconstructor

Paul S. Mischel團隊在AmpliconArchitect的基礎上整合成像學信息進行eccDNA識別的工具([10])。

工具的下載地址:

https://github.com/jluebeck/AmpliconReconstructor


 5、有關eccDNA幾個問題的思考

5.1 eccDNA與circRNA有關系嗎?

eccDNA和circRNA都是環狀的核酸分子,有沒有可能eccDNA也可以促進circRNA的產生呢?我個人認為完全有可能。eccDNA是來源于基因組的攜帶完整基因的環狀DNA分子,其中還有基因上游的增強子元件,甚至會經過多次重組整合不同染色質來源的序列,這為eccDNA所攜帶的基因表達狀態提供了全新的序列條件和調控方式,從Paul S. Mischel團隊Nature文章和Peter C. ScacheriJeremy N. Rich聯合發表的Cell文章的結果來看,eccDNA一般處于高度開放的狀態,基因的轉錄異常活躍[10, 11]),這也為circRNA的形成創造了條件。eccDNA還可以攜帶不同染色質的序列,有可能會引入不同于染色質中原基因位點的新序列元件,這也為circRNA的形成提供了新的可能。但不管怎樣,eccDNA中基因轉錄,RNA編輯的體系應該是和基因組DNA一致的,如果希望探索這方面的問題,建議首先從鑒定eccDNA全長序列入手,看有沒有特殊的序列進入eccDNA,然后再設計實驗分析其中circRNA的形成。


5.2 為什么大部分染色體外DNA都是環狀的?

DNA復制過程存在一種稱為5’-末端縮隱的問題,就是DNA復制起始必須在前體RNA的后面延長,不能從零開始DNA的復制,因此在被復制的DNA模板的5’端是沒法直接通過DNA復制過程將其補齊的,如果這樣經過多輪的DNA復制之后DNA模板會變得越來越短,這就是5’-末端縮隱問題。生物體解決這個問題有兩種方法,一種是在末端增加非基因序列來保護基因序列不會丟失,真核生物染色末端的端粒就是起這樣的作用。另一種策略是讓DNA變成環形,這樣就可以通過滾環復制的方式實現全序列的復制。細菌,病毒和酵母等低等生物的基因組呈現環形就是基于這個原因。回到我們的主角,如果基因組因為種種原因產生了一些DNA片段,細胞內也存在將這些片段互連或自連的機制(同源重組或微同源序列介導的末端連接等等)([12]),因此一些DNA片段就會最終形成環狀DNA分子。隨著細胞增殖和分裂,那些沒有成功成環的序列會因為5’-末端縮隱問題而越來越短, 最終消失。而順利成環的分子就會正常復制,假如剛好攜帶了癌基因等對細胞生長有利的基因,就會通過不對稱分布實現定向富集。當然,DNA分子成環之后能耐受外切核酸酶的降解作用,也可能是這一過程中富集環狀分子的驅動因素。上述說法是我個人的一些看法,大家如果有別的見解歡迎交流。


eccDNA雖然很早就發現和報道了,但只有到近期通過結合各種高通量測序技術之后才對它們進行了深入的分析研究。目前還有很多重要的科學問題沒有得到很好的解答,包括eccDNA的形成機制,是否存在形成eccDNA的拼接熱點?eccDNA對基因組DNA的影響和調控方式,eccDNA是否存在細胞間傳遞機制?腫瘤發生發展過程中eccDNA如何實現富集或丟失的?等等,相信隨著研究工作的不斷推進,這些問題可以陸續得到解答。


參考文獻

1. Barreto, S.C., M. Uppalapati, and A. Ray, Small Circular DNAs in Human Pathology. Malays J Med Sci, 2014. 21(3): p. 4-18.

2. Hotta, Y. and A. Bassel, Molecular Size and Circularity of DNA in Cells of Mammals and Higher Plants. Proc Natl Acad Sci U S A, 1965. 53: p. 356-62.

3. Cox, D., C. Yuncken, and A.I. Spriggs, Minute Chromatin Bodies in Malignant Tumours of Childhood. Lancet, 1965. 1(7402): p. 55-8.

4. Alt, F.W., et al., Selective multiplication of dihydrofolate reductase genes in methotrexate-resistant variants of cultured murine cells. J Biol Chem, 1978. 253(5): p. 1357-70.

5. Kohl, N.E., et al., Transposition and amplification of oncogene-related sequences in human neuroblastomas. Cell, 1983. 35(2 Pt 1): p. 359-67.

6. Shibata, Y., et al., Extrachromosomal microDNAs and chromosomal microdeletions in normal tissues. Science, 2012. 336(6077): p. 82-6.

7. Nathanson, D.A., et al., Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science, 2014. 343(6166): p. 72-6.

8. Turner, K.M., et al., Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature, 2017. 543(7643): p. 122-125.

9. Moller, H.D., et al., Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 1069.

10. Wu, S., et al., Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature, 2019.

11. Morton, A.R., et al., Functional Enhancers Shape Extrachromosomal Oncogene Amplifications. Cell, 2019.

12. Paulsen, T., et al., Discoveries of Extrachromosomal Circles of DNA in Normal and Tumor Cells. Trends Genet, 2018. 34(4): p. 270-278.

13. Schimke, R.T., Gene amplification in cultured animal cells. Cell, 1984. 37(3): p. 705-13.

14. Stephens, P.J., et al., Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell, 2011. 144(1): p. 27-40.

15. Vogt, N., et al., Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(31): p. 11368-73.

16. Sunnerhagen, P., et al., Molecular cloning and characterization of small polydisperse circular DNA from mouse 3T6 cells. Nucleic Acids Res, 1986. 14(20): p. 7823-38.

17. Motejlek, K., et al., Increased amount and contour length distribution of small polydisperse circular DNA (spcDNA) in Fanconi anemia. Mutat Res, 1993. 293(3): p. 205-14.

18. Smith, G., et al., c-Myc-induced extrachromosomal elements carry active chromatin. Neoplasia, 2003. 5(2): p. 110-20.

19. L'Abbate, A., et al., Genomic organization and evolution of double minutes/homogeneously staining regions with MYC amplification in human cancer. Nucleic Acids Res, 2014. 42(14): p. 9131-45.

20. Verhaak, R.G.W., V. Bafna, and P.S. Mischel, Extrachromosomal oncogene amplification in tumour pathogenesis and evolution. Nat Rev Cancer, 2019. 19(5): p. 283-288.

21. Tandon, I., et al., Extrachromosomal circular DNAs: an extra piece of evidence to depict tumor heterogeneity. Future Sci OA, 2019. 5(6): p. FSO390.

22. Cohen, S. and D. Segal, Extrachromosomal circular DNA in eukaryotes: possible involvement in the plasticity of tandem repeats. Cytogenet Genome Res, 2009. 124(3-4): p. 327-38.

23. van de Werken, H.J., et al., Robust 4C-seq data analysis to screen for regulatory DNA interactions. Nat Methods, 2012. 9(10): p. 969-72.

24. Fang, R., et al., Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Res, 2016. 26(12): p. 1345-1348.

25. Deshpande, V., et al., Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 392.


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