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circRNA的m6A修飾再發一篇Nature Communications文章
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2019-10-18 | 165 次瀏覽 | 分享到:

1016日, Nature Communications雜志在線發表了一項circRNA m6A修飾的文章,報道發現m6A修飾的circNSUN2可結合YTHDC1并促進出核,進一步結合IGF2BP2促進HMGA2 mRNA的穩定,最終促進大腸癌的肝轉移增強[1]。文章的通訊作者是中山大學附屬腫瘤醫院的謝丹教授徐瑞華教授Wang Fengwei



m6A為代表的RNA修飾是近幾年的熱點研究方向,circRNA目前已有多篇文章報道可攜帶m6A的修飾。推薦閱讀:
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重大發現:circRNA存在細胞特異性的m6A修飾
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本文的機制表明m6A修飾可調控circRNA的出核,是circRNA修飾研究的重要進展。下面就讓我們一起學習一下這篇文章:


如何找到
circNSUN2分子的?
作者通過芯片法分析了兩對大腸癌(CRC)與癌旁的circRNA表達譜,共找到13167circRNA分子。基因拷貝數異常(CNV)的區域經常是腫瘤驅動基因的位置,作者提出是否該區域的circRNA與腫瘤發生發展有關?于是作者選擇了CRC最常見的CNV 位點(拷貝數增加的位點:5p15.318q24.218q24.313q12.13:拷貝數降低的位點:5q2118q21.1),芯片篩選得到的circRNA中比對到這些位點的circRNA104種,其中與對應位點的增高或降低趨勢一致的為38種,9circRNA的變化趨勢在兩例腫瘤標本中是一致的。為進一步分析篩選有價值的分子,作者在97CRC的標本庫中分析了這9circRNA的表達情況,其中4circRNA在超過75%的標本中呈現出高表達的趨勢。這其中circNSUN220例原發灶和對應肝轉移的標本中表現為肝轉移組表達的顯著增高,并且伴隨著肝轉移程度的增加,circNSUN2的表達也呈現顯著的增高趨勢。在97例標本群體中,circNSUN2高表達的組生存狀況顯著低于低表達組。基于這些數據,本文選擇circNSUN2作為研究的目標分子。


1 circNSUN2CRC中高表達,與肝轉移相關 ([1]

 


circNSUN2
的鑒定
Sanger測序,反向引物設計,RNase R消化,Northern blot,放線菌素D處理后穩定性分析, FISH和亞細胞組分分析實驗鑒定了circNSUN2的疾病情況。circNSUN2主要定位于胞質中。

2 circNSUN2的鑒定 [1]

 

體內實驗證明circNSUN2CRC的肝轉移相關
TC17細胞或PDX模型的細胞做shRNA穩定敲降或過表達circNSUN2,分析肝轉移效率的影響情況。結果均表明干擾circNSUN2可以降低CRC的肝轉移而過表達circNSUN2則促進肝轉移。

3  動物模型實驗證明circNSUN2促進CRC的肝轉移 ([1]

 

circNSUN2YTHDC1結合后促進出核

為探索circNSUN2的分子機制,作者通過RNA pull-down分析了相互作用的蛋白,差異條帶質譜分析后發現了YTHDC1IGF2BP2pull-down產物Western檢測,anti- YTHDC1RIP實驗均證明了circNSUN2YTHDC1的相互作用。YTHDC1是已知的RNA m6AReader分子之一,上述結果證明了circNSUN2YTHDC1的相互作用,是否意味著circNSUN2也可能攜帶了m6A修飾?meRIP實驗證明了circNSUN2確實可以被m6A的抗體富集。序列分析預測到了circNSUN2中存在GAACU motif(已知的m6A修飾位點),設計突變實驗,將其中的A突變為GEMSA實驗分析突變前后與YTHDC1的相互作用情況,結果表明突變后不再與YTHDC1相互作用。這就證明了circNSUN2的確存在m6A修飾,該修飾方式介道了與YTHDC1的相互作用。干擾YTHDC1后發現circNSUN2的亞細胞分布發生了變化,干擾后核內circNSUN2的豐度增高了。FISH定位分析也驗證了這一現象。

4  circNSUN2YTHDC1結合后促進出核 [1]

 

circNSUN2IGF2BP2結合

pull-down實驗中還發現了circNSUN2可結合IGF2BP2,作者也對該蛋白進行了類似的分析,包括pull-downWestern分析,RIP實驗。免疫熒光-FIH共定位分析也證明了circNSUN2IGF2BP2的相互作用。IGF2BP2是一種RNA結合蛋白,與mRNA的穩定性有關,已知在CRC中與侵襲有關。作者首先個截短突變體實驗分析了IGF2BP2結合circNSUN2的結構域位置,結果表明KH3-4 di-domain是特異性結合circNSUN2的結構域。之前已報道IGF2BP2結合RNAmotifCAUH (H = A, U or C),在circNSUN2中有該基序存在,于是基于位點突變前后EMSA分析,確定了circNSUN2IGF2BP2結合。

5 circNSUN2IGF2BP2結合 ([1]

 

circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2復合體促進HMGA2 mRNA穩定
已知IGF2BP2mRNA的穩定性有關,那么這里發現的circNSUN2IGF2BP2的相互作用是否會影響一些mRNA的穩定性?為弄清楚這個問題,作者設計了干擾circNSUN2前后分析轉錄組的差異情況,結果有644mRNA在干擾circNSUN2豐富發生顯著變化。IGF2BP2通常結合mRNA 3UTR區富含AU的序列,基于這一規律,作者基于已發表的CLIP數據分析了這644mRNA的情況,其中有21mRNA一直是可以結合IGF2BP2的。circNSUN2CRC肝轉移有關,結合QPCRWestern檢測的數據,最終選擇HMGA2作為靶分子。RNA pull-down實驗證明了circNSUN2的確可以捕獲HMGA2 mRNA。干擾circNSUN2HMGA2 mRNA的穩定性顯著降低。熒光素酶報告基因實驗,免疫熒光-FISH共定位分析證明了circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2復合體與HMGA2 mRNA的結合。IGF2BP2分段突變和circNSUN2干擾等實驗進一步證明了他們相互作用的位點和序列信息。

6  circNSUN2/ YTHDC1/IGF2BP2復合體功能 ([1]

 

體內實驗證明HMGA2circNSUN2調控CRC肝轉移的介導者
最后,作者在體內模型中驗證了上述分子模型與CRC肝轉移的相關性。單獨干擾circNSUN2可抑制肝轉移,但如果同時過表達HMGA2則促進肝轉移。


2 體內模型證明circNSUN2通過HMGA2促進CRC肝轉移 ([1]

 

本文的故事非常精彩,有幾個值得學習的思路總結如下:
1. 從已知的疾病相關CNV位點(很可能是腫瘤的驅動基因所在的位置)出發收縮circRNA篩選的目標,這樣可能有助于找到對疾病發生發展關系更緊密的分子。
2. RNA Pull-down找到了circRNA相互作用的蛋白,是揭示circNSUN2分子功能的關鍵一步。
3. 通過circNSUN2的相互作用蛋白的捕獲,發現了m6AReader蛋白YTHDC1,進一步發現了circNSUN2出核的機制。本文最初并不是要分析circRNAm6A修飾的,互作蛋白的捕獲幫助作者發現了circNSUN2m6A修飾對它出核的作用。

總之,本文的工作非常精彩,從小樣本臨床標本的分析入手,找到CRC肝轉移相關的circRNA分子,然后基于RNA Pull-down分析,發現了circNSUN2的相互作用蛋白YTHDC1IGF2BP2,進而從干擾circNSUN2前后轉錄組差異分析結合作者所發現的現象找到HMGA2 mRNAcircNSUN2促進CRC肝轉移的介導分子,故事前后邏輯銜接非常通順,是circRNA機制研究的重要參考工作。


參考文獻
1.
Ri-Xin Chen, X.C., Liang-Ping Xia, Jia-Xing Zhang, Zhi-Zhong Pan, Xiao-Dan Ma, Kai Han, Jie-Wei Chen, Jean-Gabrie Judde, Olivier Deas, Feng Wang, Ning-Fang Ma, Xinyuan Guan, Jing-Ping Yun, Feng-Wei Wang, Rui-Hua Xu, Dan Xie N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nature Communications, 2019.



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