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分子實驗常見問題分析
來源: | 作者:pmo86933e | 發布時間: 2016-05-11 | 4009 次瀏覽 | 分享到:

Q1: 提質粒沒有明顯的沉淀,能說明是沒有提出來嗎?跑完電泳還是沒有條帶能證明質粒沒提出來嗎? 

A: 提質粒的時候沒有明顯的沉淀,也有可能是由于你加的乙醇量少或異丙醇量不足或質量有問題。或者質粒太少了難以用肉眼看出。跑完電泳還是沒有條帶也有可能是跑膠時配置膠出問題,或染色劑不夠,或者你加的質粒量少。要具體情況再分析。 


Q2:質粒條帶很暗而且通常只有一條帶是什么問題? 

A:沒有用試劑盒提取的話可能考慮技術問題。如果常做質粒的提取,且用的是試劑盒,還出現這種情況,就要從質粒本身著手考慮了:首先做個PCR鑒定一下,確保有質粒的情況下,很可能質粒是低拷貝的,如此就要用大量的細菌來提取質粒。 

一般的用可以用水煮法提(1ml菌液離心,沉淀加50μl DEPC 水,100度水煮3-4分鐘,離心取上清夜,含有大量的質粒)用1-2μl作為模板跑PCR效果很好。 


Q3: 用分光光度計測得的質粒濃度很高,但是跑出來的電泳卻看不到條帶,這是什么原因? 

A: 三種可能: 

1)可能EB有問題,應同時檢查同一塊膠上其它樣品是否有條帶。

2)計算OD260/280比例,有可能為蛋白污染所致。

3)稀釋后上樣的濃度過低。 


Q4: 提質粒電泳顯示應該幾條帶?哪種情況較好?

A: 質粒在電泳時會出現三種情況的圖譜: 

1)三條帶,按照電泳泳動速度(快到慢)排列為:超螺旋、缺口閉環、開環。經常會出現。

2)兩條帶,超螺旋/閉環/開環 任意兩種。

3)一條帶,超螺旋。  至于那種情況好,要看我們進一步實驗的目的了。 

1)進行分子克隆的操作,構建載體。這隨便那種情況都可以,不會影響你的后續實驗。所以在這種情況下,沒必要評比誰好誰不好。

2)進行細胞轉染。因為轉染必須要超螺旋,所以它們的質量好壞順序是: 3)、2)、1)。 


Q5: 如何降低質粒變性超螺旋的含量? 

A: 理論上,用堿裂解法抽提質粒,變性超螺旋的出現是不可避免的。之所以大家沒有非常在意,一是因為它的存在似乎對酶反應沒有任何影響,二是因為它的含量并不一定高到被用電泳觀察到。抽提使用相對過剩的溶液,在加入溶液 II 后,體系能在 1 分鐘內變澄清,再快速加入溶液 III,這樣基本上能將變性超螺旋的出現控制在電泳看不見的水平。 (變性超螺旋電泳時比正常超螺旋跑得快一點點。)


Q6: 質粒大小如何在電泳中的鑒定? 

A: 1.從細菌中大量提取的質粒電泳時,不一定均出現三條帶,有時會出現兩條,甚至一條(一般是超螺旋的質粒),這跟上樣量也有些關系。出現不同的結果都是由抽提質粒時的操作手法造成的。如果嚴格按照操作步驟,超螺旋的質粒會較多。 

2.酶切將質粒線性化以后,才可以用marker判斷大小。如果有三種構像,可以用中間那條帶與marker比較判斷大小。

3.商品化的質粒估計應該大部分是超螺旋構像。 

4.酶切后線性化條帶電泳時所處的位置就指示質粒的大小。 


Q7:首次進行小量制備質粒時,有時會發現質粒DNA不能被限制酶所切割是為什么? 

A: 這幾乎總是由于從細菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數情況下,用酚:氯仿對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質。如果總是依然存在,可用離心柱層析注純化DNA。


Q8: 大提質粒產量低的原因是什么? 

A: 大體積搖菌時,注意培養基最多只能占搖瓶體積的1/4,單純地增加搖速是沒有用的。另外,加溶液I裂解時,要注意充分裂解。你的溶液II加入后,溶液沒有澄清,說明一是菌體沒有裂解好,二是溶液II的酸堿度有問題或者其他原因。在溶液II沒有完全澄清的情況下,加入溶液III, plasmid就會包裹在基因組的粘團之中,隨沉渣一起被沉淀下來。不信你把沉渣再加入溶液II和III,會再提出一部分質粒出來。建議可使用Kit以提高質粒產量。 


Q9: 小提質粒的產量很高,但大提的產量不高,如何注意大提質粒的手法和細節? 

A: 1. 溶液1,5ml;溶液2,10ml;溶液3,7.5ml 

2.加溶液2后,緩慢顛倒數次,見到蛋清樣液體掛在離心管壁上,開離心管蓋后,有拉絲現象。 

3.異丙醇后,烤沉淀的時間不宜太長,質粒烤得太干,一是有損失,二是難溶。 

4.加TE溶解質粒時,如果30分鐘后還不溶,可能是TE中,質粒達到過飽和,補加適量的TE即可 


Q10: 超過10K的質粒轉化要注意什么問題? 

A: 選擇高效轉化效率的感受態細胞,DH5a可以做為較大質粒的宿主菌。


Q11:沉淀質粒DNA的方法有哪些?可以用什么代替無水乙醇?

A: 用無水乙醇沉淀DNA,這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會起任何化學反應,對DNA很安全,因此是理想的沉淀劑。一般實驗中,是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來替代無水乙醇(因為無水乙醇的價格遠遠比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時,就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95%乙醇代替無水乙酵,最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。 


Q12: 加核糖核酸酶降解核糖核酸后,需不需要再要用SDSKAc來處理?為什么? 

A: 需要。加進去的RNase本身是一種蛋白質,為了純化DNA,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀,再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物,使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀,去除RNase。在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到較好效果。 


Q13:在保存或抽提DNA過程中,一般采用什么緩沖液?為什么?

A: 采用TE緩沖液。在基因操作實驗中,選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(pKa=7.2)和硼酸系統(pKa=9.24)等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH),可作DNA的保存液,但在轉化實驗時,磷酸根離子的種類及數量將與Ca2+產生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反應時,不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同,有的要求高離子濃度,有的則要求低鹽濃度,采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統,由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA時,大都采用Tris-HCl系統,而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。如下游有特殊需要也可用水保存DNA。

 

Q14: 如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來沉淀DNA 

A: 采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同,PEG的濃度低,選擇性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的濃度只需1%左右,小分子所需PEG濃度高達20%。本實驗選擇性沉淀4.3kb的pBR322質粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30% PEG,其最終PEG濃度為12%。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。


Q15: 用酚與氯仿抽提質粒DNA時,還要加多少量的異戊醇?

A: 在抽提質粒時,為了混合均勻,必須劇烈振蕩容器數次,這時在混合液內易產生氣泡,氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力,所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般采用氯仿與異戊酵為24:1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25:24:1(不必先配制,可在臨用前把一份酚加一份24:1的氯仿與異戊醇即成),同時異戊醇有助于分相,使離心后的上層水相,中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。 


Q16: 為了提高質粒的轉化效率, 實驗中要考慮幾個重要因素?

A: 1. 細胞生長狀態和密度: 不要用經過多次轉接或儲于4℃的培養菌,最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好,可通過監測培養液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時,細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率.

2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%。 

3. 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。 

4. 防止雜菌和雜DNA的污染:整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。


Q17:質粒抽提的關鍵性控制因素有哪些? 

A: (1)搖菌時間——過夜培養是一個普遍接受的概念,而且適合大部分情況。如果出現了問題,調整培養時間會有幫助:Nick 多,則增加培養時間;酶切出現問題,則減少培養時間。

(2)起始菌體量——不僅只是“從多少 ml 菌液中抽提質粒”,一定要養成每次都觀察菌體量的習慣,因為質粒畢竟是在菌體中,而且,抽提質粒所用的試劑量,都只與菌體量有關。 

(3)菌體的徹底懸浮——如果沒有徹底懸浮菌體,則殘留的菌體團塊在溶液 II 加入后,變成一個外圍幾乎徹底裂解,往里不完全裂解,中間沒有裂解的團塊。這個團塊在溶液 III 加入后,會有一部分蛋白質繼續存在于溶液中,成為蛋白質殘留的最大根源。

(4)使用相對過量的試劑——這是適合所有核酸抽提的建議。試劑相對過量的好處是:穩定性好,純度高,操作更簡單。如果認為這樣不經濟,就少用一點菌體。 

(5)裂解時間——加入溶液 II 后,混勻,體系最好能立即變得清澈。體系如果變得清澈了,馬上加入溶液 III 中和。如果體系不馬上變清澈,下次少用一點菌液,或者多用一點溶液。如今的質粒設計得越來越復雜了,奇怪的現象也越來越多,而所有的奇怪現象,多與裂解時間有關。 

(6)中和的操作——在 1.5ml 離心管中加入溶液 III 后,先顛倒兩次,使管底朝上,用指頭彈擊管底數次,再顛倒混勻。效果非常好。

(7)中和后的離心去蛋白——一定要將蛋白質徹底離心下去。如果發現離心后仍然有蛋白質漂浮在液面,繼續離心的效果并不好;而將上清倒入另外一個離心管中,再離心,效果要好許多。 

 

Q18: 用堿法大提質粒最后誤用的10TE溶解沉淀,對質粒有影響嗎?如何補救? 

A: 離子濃度可以影響DNA的穩定性,時間長了會導致DNA斷裂等。離子濃度過大可能會影響下游的操作,當然這只是可能;簡易將質粒重新沉淀一下:加1/10體積 3M ph5.2的醋酸鈉、2倍體積的無水乙醇沉淀即可,這一步還有純化作用,當然也可以重新離心,再換水溶解或1倍TE溶解。


Q19: 如何降低 RNA 殘留? 

A:RNA 的去除,首先是使用RNase 消化。在溶液 I 中加入高濃度的 RNase A (100ug/ml),或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的質粒,都可以降低 RNA 殘留,但都不能徹底去除。幸運的是,RNA 的殘留并不影響酶切等最常用的用途。如果想徹底去除 RNA 殘留,可以用試劑盒,或者使用對4個堿基都作用的 RNase。


Q20:如何降低 gDNA 殘留? 

A: gDNA 的殘留問題,必須在抽提過程中解決,否則,就只能用膠回收方法處理了。gDNA 越大,越難于復性,也就越容易被去除;所以,一定要盡可能不打斷 gDNA。裂解體系越粘稠,gDNA 越容易被扯斷;操作手法越重,gDNA 也越容易被打斷。溫和操作,使用相對過剩的試劑,是降低 gDNA 殘留的最好方法。


Q21:如何降低蛋白質殘留? 

A: 蛋白質的去除,主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白質復合物的形成。雖然將中和后的體系置于 4C 一段時間,可以形成更多的該不溶復合物,從而使蛋白質殘留更少,但實踐證明這樣做并不是必須的,除非是大量抽提。只要加入溶液 I后的懸浮,加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均勻徹底的,蛋白質的殘留就應該在可以滿足實驗要求的水平;而只有溶液的用量足夠,甚至過剩,才能確保裂解和中和是徹底的。當然,試劑盒及苯酚的使用,是可以更進一步降低蛋白質的殘留的。

 

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